蛋白质乙酰化修饰组学技术:乙酰化修饰是体内保守的可逆转的蛋白修饰,对细胞核内转录调控因子的刺激有着重要的作用。此外,还存在的非组蛋白乙酰化修饰参与了代谢通路及代谢酶活性的调节。采用肽段预分离降低高丰度组蛋白对蛋白乙酰化鉴定的影响,再结合免疫共沉淀通过抗体富集乙酰化的肽段,从而实现乙酰化的鉴定及定量。样品要求:1、SDS-PAGE条带:5个以上可见考染条带。2、溶液(目标蛋白质):目标蛋白总量>50μg,目标蛋白浓度>80%。3、溶液(大规模混合蛋白质):蛋白总量>1mg,蛋白浓度>1μg/μl。质谱可以用于已知和未知的翻译后修饰检测。杭州甲基化修饰蛋白质组学领域
质谱分析乙酰化蛋白质组:质谱分析技术可以对蛋白质组中的乙酰化蛋白进行鉴定、乙酰化位点定位以及定量。当质谱用于乙酰化定量蛋白组研究中时,因为乙酰化蛋白质在生物样本中含量低、动态范围广,需要先对乙酰化肽段进行富集,然后再对富集得到的乙酰化肽段样品进行定量分析。质谱定量乙酰化蛋白组采用肽段预分离降低高丰度蛋白的影响,结合免疫共沉淀通过高效的抗体富集乙酰化的肽段,从而实现大规模乙酰化的鉴定及定量。为了鉴定和定量更多的乙酰化肽段,在酶切过程中还可使用多种不同的酶对蛋白样品进行酶切。山东蛋白质泛素化修饰组学方法蛋白磷酸化修饰过程是通过蛋白激酶催化,将磷酸基团从ATP转移到多肽底物的丝氨酸、或酪氨酸残基上。
蛋白翻译后修饰检测:由于PTMs在基础生物学以及疾病发病机理中的重要性,因此非常需要对蛋白质的翻译后修饰进行检测。对蛋白翻译后修饰进行研究时通常需要富集步骤,因为这些翻译后修饰的蛋白质相对含量较低。大多数PTMs的检测方法与富集策略结合在一起开发,以提供比较好的机会来识别、验证和研究蛋白翻译后修饰的功能。但是,在检测已有特异性翻译后修饰抗体的修饰蛋白质时,可能不需要富集步骤。质谱技术,通过测定肽段的分子量可以对该肽段的翻译后修饰情况进行检测,并可以对翻译后修饰蛋白进行定性和定量分析。
蛋白磷酸化修饰过程:蛋白磷酸化修饰这一过程是通过蛋白激酶催化,将磷酸基团从ATP转移到多肽底物的丝氨酸、苏氨酸,或酪氨酸残基上。并且磷酸化修饰的过程是可逆的,去磷酸化反应由蛋白磷酸酶催化完成。蛋白磷酸化检测方法:Western Blot检测方法:Western Blot是检测蛋白磷酸化水平的常用方法,主要过程为先利用SDS-PAGE分离蛋白质,随后将蛋白质转移到PVDF膜上,然后使用特异性识别磷酸化蛋白的抗体来鉴定目标蛋白的磷酸化水平。只有被磷酸化修饰的蛋白才会在相应分子质量的地方显现特异性蛋白条带。乙酰化修饰对细胞核内转录调控因子的刺激有着非常重要的作用。
蛋白质学组翻译后修饰自下而上分析策略:常用的糖蛋白分离和富集技术有:a. 凝集素亲和技术;b. 肼化学富集;c. 亲水性相互作用色谱法;d. β-消除/迈克尔加成反应。基于质谱的糖蛋白鉴定和糖基化位点测定方法有:a. PNGase F酶法;b. Endo H酶法;c. 三氟甲烷磺酸(TFMS)法。泛素化:泛素是一种由76个氨基酸组成的多肽,在真核生物中高度保守,可通过异肽键与目标蛋白赖氨酸残基的氨基进行共价连接。泛素化蛋白的富集主要基于标记,泛素用亲和标签(通常为6xHis)进行标记,并通过镍螯合色谱亲和提取泛素化蛋白。由于泛素的C端为Arg-Gly-Gly结构,经胰蛋白酶水解后,Gly-Gly保留在修饰蛋白的肽链上,使肽的质量增加114,因此可作为泛素定位位点的质量标记。用HPLC对样品进行预分离,使用针对特定残留结构的抗体富集泛素化肽,可很大程度上提高泛素化蛋白的浓度。串联质谱可以鉴定泛素化位点。蛋白质磷酸化修饰组学具有可靠性。上海蛋白质磷酸化修饰组学主要方式
蛋白质磷酸化修饰鉴定方法有免疫印迹技术。杭州甲基化修饰蛋白质组学领域
蛋白质翻译后修饰组学:蛋白质翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)是指对翻译后的蛋白质进行共价加工的过程。它通过在一个或多个氨基酸残基加上修饰基团,可以改变蛋白质的物理、化学性质,进而影响蛋白质的空间构象和活性状态、亚细胞定位、折叠及其稳定性以及蛋白质-蛋白质相互作用。蛋白质翻译后修饰的丰度变化在生命活动研究中具有重大意义,异常的翻译后修饰会导致多种疾病的发生。质谱可以分辨蛋白质修饰前和修饰后分子量上的变化,因此只要知道靶蛋白翻译后修饰前后分子量的变化,就能对翻译后修饰方式进行鉴定和定量。杭州甲基化修饰蛋白质组学领域
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