TaqMan 方法的优点：需要在探针和目标分子（靶点）之间发生特异性的水解（杂交），方可生成荧光信号。可使用明显不同的报告基因染料标记探针，在一个反应管内扩增并检测两个不同的序列。无需PCR后处理，减少分析工作量并节省材料成本。TaqMan方法的缺点：TaqMan方法的主要缺点在于需要根据不同的序列，合成不同的探针。SYBR Green I染料试剂。一般将可与双链DNA发生结合的小分子分为以下两类：嵌入剂、小沟结合物。无论哪种结合方法，用于PCR实时检测的DNA结合染料都需要满足以下两个条件：结合至双链DNA时，会有增强的荧光对 PCR 不会产生抑制我们开发更加优化的条件，使得SYBR Green I染料的使用不会对PCR产生抑制并带来相对于溴化乙锭更为灵敏的检测。Quantagene q225系列qPCR 43分钟完成实验，加3分钟做完熔解曲线只需43分钟即可完成40循环的常规qpcr实验。珠三角快速qPCR仪使用说明

阴性对照一般是指用水代替模板的反应孔，体系中除了模板，包括了其他的反应组分。由于qPCR的高灵敏性，阴性对照有出现扩增信号的情况，那么在针对这类问题时，我们需要判断其原因所在。使用染料法进行qPCR实验时，首先查看阴性对照的溶解曲线主峰是否跟阳性孔的主峰位置一致。如果一致，要看两者Cq相差多少，比如，针对某一种引物的实验样品Cq值为28. 5，阴性对照的Cq值为33. 6，由于Cq值相差大于5，如果按95%的扩增效率计算，两者模板量相差28倍之多，对分析数据影响不大，所以实验样品的Cq值还是可以采用的；但是，如果两者的Cq值相差 1~2，这说明阴性对照中有较大的模板污染，则需要考虑更换试剂或引物，分区加样，重新实验。如果不一致，阴性对照主峰对应的Tm值小于阳性孔的Tm值，则可能是引物性能不好，无模板或使用低浓度模板下会出现引物二聚体，这种情况则需要考虑更换引物，保证引物特异性以及扩增效率。珠三角快速qPCR仪使用说明PCR 反应中通过控制温度变化使得核酸分子重复地解链与延伸，从而实现对目的片段的指数扩增。

免疫沉淀——捕获并分离蛋白质-DNA复合物使用抗体捕获蛋白质-DNA复合物中的目标蛋白质是实验成功的关键因素。抗体免疫沉淀并从细胞核组分中分离蛋白质，去除不相关的细胞物质。使用抗体结合磁珠完成所得抗体-蛋白质-DNA复合物的纯化。经过孵育后，充分洗涤磁珠-抗体-蛋白质-DNA复合物，纯化并洗脱蛋白质-DNA复合物。制备DNA——解交联和DNA纯化:现在含有目标蛋白质的染色质片段已分离，需要解交联并纯化DNA。解交联通常采用高热孵育和/或消化来完成。注意：此时可以停止ChIP。经过解交联和/或DNA纯化后，可以将样品于-20°C储存。

与标准 PCR 一样，SYBR Green 方案由变性、退火和延伸阶段组成。 不同之处在于，您在 qPCR 设置期间将一些双链 DNA 结合染料 SYBR Green I 添加到预混液中。 这种荧光染料在延伸阶段嵌入到双链 DNA 序列中，显示出荧光信号的强烈增加。 在每个热循环结束时测量此信号将使您能够确定存在的双链 DNA 的数量。SYBR Green 检测的缺点是染料会与任何双链 DNA 序列结合。 这意味着您还可以检测非特异性 qPCR 产物（例如引物二聚体）发出的荧光。 为消除这种风险，通过执行熔解曲线分析检查反应特异性，或使用 TaqMan 方法。q225 出色的热循环系统设计使得40 个循环的常规 qPCR 可以在短短43 分钟内轻松完成，让您的工作效率获得质提升 。

内标在传统定量中的作用：由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．内标对定量PCR的影响：若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为***。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。终点法检测（也称 “读板检测”）测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。珠三角快速qPCR仪使用说明

qPCR只能实现相对定量，即必须使用标准品生成标准曲线，才能进行定量。珠三角快速qPCR仪使用说明

qPCR中的荧光探针是一种短链寡核苷酸，带有荧光基团和淬灭基团，它可以特异结合目的产物的DNA序列。其检测原理是荧光共振能量转移（FRET），即荧光基团和淬灭基团在目标DNA分子扩增过程中因为聚合酶的外切活性从而水解分离使荧光信号的释放；随着扩增过程的推进，机器实时检测增强的荧光信号，从而产生终的荧光扩增曲线。根据修饰基团标记和能量转移方式，可以将探针分为TaqMan探针、分子信标和其他探针。TaqMan探针（荧光淬灭水解探针）现今常用的TaqMan探针主要是水解探针，其多是5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团的短单链寡聚核苷酸。在qPCR反应中，基于TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性，对TaqMan探针进行切割，使荧光基团和猝灭基团分离，荧光基团发出的荧光信号不会被淬灭，释放的荧光信号被机器接收。TaqMan探针的qPCR相比于染料法多了一条TaqMan探针，可以特异性结合DNA序列，因而具有更好的特异性，但探针合成价格偏高。珠三角快速qPCR仪使用说明

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