qPCR技术的本质是PCR技术，在扩增的每个循环中模板DNA通过变性、复性、延伸三个阶段形成更多数量的子代DNA，为下一个循环提供模板DNA。在每个循环结束后，仪器会激发荧光物质并检测一次荧光信号，那么每一个循环都会对应一个荧光信号值，将所有荧光信号值用光滑的曲线进行连接起来，便是 qPCR扩增曲线。如图所示，根据qPCR扩增曲线整体趋势，整个扩增过程主要分为四个时期，分别是基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。在基线期和平台期，荧光信号均维持水平状态，均不适用于对初始模板进行定量分析。在线性增长期，虽然扩增反应仍在进行，但随着反应产物的积累，PCR反应受到明显抑制导致扩增效率不断降低，此时产物不再以指数形式增长，同样不适用于定量分析初始模板量。根据qPCR扩增曲线整体趋势，整个扩增过程主要分为四个时期，基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。佛山qPCR仪设置

交联和裂解——稳定复合物并分离核组分:第一步对时间要求严格并且需要优化。体内共价交联稳定蛋白质-DNA相互作用并于特定时间点进行分析。通常采用甲醛交联，加入甘氨酸以终止反应。交联剂渗透到完整细胞中并将蛋白质-DNA复合物锁定在一起从而进行分析。交联剂在整个过程中保持复合物稳定，但其作用必须是可逆的才能用于ChIP。一些非常稳定的蛋白质-DNA相互作用则不需要交联。接下来，使用裂解液透化细胞膜，释放细胞组分，然后蛋白质-DNA复合物变得可溶。去除细胞溶质蛋白以减少背景信号并增加灵敏度。注意：此时可以停止ChIP测定。 经过交联，淬灭和洗涤细胞沉淀后，将裂解物于-80℃储存。Quantagene q225mxqPCR仪采购qPCR通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

qPCR和dPCR:研究人员已经通过两种方式克服了定量PCR分析的挑战：实时定量PCR(qPCR)和数字PCR(dPCR)。qPCR主要使用插入染料或荧光探针(例如TaqMan)。通过监测PCR期间的荧光强度，可以比较多个样品的DNA水平。数字PCR(dPCR)的基本工作原理很简单。先将样品分为多个PCR反应，每个反应多包含一个模板。然后通过对阳性和阴性反应进行计数来确定初始样品中模板分子的数量。尽管qPCR和dPCR都能够定量样品中的核酸，但它们有一个重要的区别。qPCR只能实现相对定量(例如，样品A的目标序列是样品B的目标序列的两倍)，除非使用此标准生成标准曲线。数字PCR本身是定量的，不需要标准曲线。另一方面，qPCR技术更加成熟和众所周知，市场上有大量商业产品可供选择。dPCR仍然是小的新鲜肉。它不如qPCR使用且价格昂贵。与dPCR相比，qPCR更适合于高通量分析，并且动态范围广。

染色质片段化——DN段化:细胞核材料片段化是获得良好的ChIP 分辨率的关键因素，理想情况下的片段大小在 200 到 800 bp对之间。剪切是难控制的步骤之一。通过超声处理和/或核酸酶/酶促消化可以实现剪切，各有利弊。超声处理需要大量的手动操作时间，但非常适合难以裂解的细胞；酶促消化不需要手动操作，适用于大量样品的处理，但其剪切位点不是随机的。两种方法都需要根据具体细胞系进行优化。注意：此时可以停止ChIP。经过剪切/消化染色质后，可以将样品于-80°C储存。避免反复冻融。在进行大量SNP标记分型时无需合成荧光探针和荧光引物。可以的节省实验成本。

传统定量PCR方法简介：1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。荧光检测系统可接收荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号累积和PCR产物形成是同步。华南地区快速qPCR仪设置

TaqMan方法通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。佛山qPCR仪设置

在扩增曲线上，指定某个荧光强度值时可对应得到达到这个值所需的循环数。选择合适的荧光强度值，该值的水平线可以切割到所有处于指数增长期的扩增曲线，这样的荧光强度值称为荧光阈值（threshold）。在荧光进入指数期初阶段的荧光强度值符合这一特点。一般PCR扩增的初始循环（默认3~15个循环），荧光信号变化不大，接近直线，称为基线（baseline），所以通常仪器默认的阈值是PCR反应~15个循环（荧光本底信号）的荧光信号标准偏差的10倍。当然，实际还需要结合PCR扩增效率、线性回归系数等综合考虑。也可以将阈值手动设置为大于荧光背景值和阴性对照（NTC）的荧光比较高值之间（进入指数期的初阶段）。佛山qPCR仪设置

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