相对定量实验方法包括两种重要方法：ΔΔCT Method：使用内参基因定量所研究样品和参照样品的目的基因。内参基因与目的基因可以同时反应，也可以单独反应；双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。定量需要由标准曲线建立Ct值跟拷贝数之间的关系，标准曲线由标准品生成，标准品可以是已知浓度的RNA、质粒或合成的寡核苷酸链生成，定量未知模板时标准样品和未知样品必须同时反应。实时荧光定量PCR指在PCR反应体系加入荧光基团，荧光信号实时监测PCR,通过标准曲线对未知模板进行定量分析.珠海快速qPCR仪设置

PCR：Polymerase chain reaction. 是体外模拟生物的DNA 复制。需要DNA 聚合酶，DNA 模板，两端引物，脱氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP, dTTP),以及适当的缓冲体系。PCR 产物的增长形式为２N (如果各种试剂和外部所加条件均理想化，N 是循环数)。实际中，扩增效率不为100％。Real time PCR 是定量PCR 的一种，当然是在PCR 的基础上发展出来的。（普通）PCR 包含很多因素，属性，如：试剂，温度，循环数，程序，PCR 产物（扩增子，amplicon）的量，扩增曲线（扩增子累积曲线），掺错率，扩增子长度。一般来说，人们关心的是扩增子的量。而real time PCR 主要利用的是扩增曲线（amplification curve）, 循环数；扩增子长度，扩增效率，扩增子多少，也加以考虑。珠海快速qPCR仪设置TaqMan方法通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。

原理：在DNA扩增反应中，通过荧光化学物质测定每次PCR循环后产物总量。目的：实现定量而不止是定性分析。通过与内参基因进行对比，对样品中的特定基因进行相对表达量的计算，以实现定量分析。qPCR的检测方法有两种，SYBRGreenl法和TaqMan探针法，下面介绍常用的SYBRGreenl法。原理：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，使其特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。试剂及仪器：Hieff®QpcrSYBR®GreenMasterMix试剂(翌圣)和ABI7500Real-TimeSystem实时荧光定量PCR仪进行qRT-PCR扩增。

双杂交探针是两个特异性探针，一个只5’端标记荧光基团，另一个只3’端标记猝灭基团。这两个探针序列和模板特异性结合，结合的位置非常邻近。在qPCR反应的退火阶段，当两个探针与模板结合时，位于两个探针头尾的荧光基团之间产生FRET现象，促进受体的荧光基团释放一种波长的荧光信号，从而达到实时监控反应进程的目的。Amplifluor系统包括两个特异性引物和一条检测探针（UniPrimer），其中一条引物的5’末端带有部分序列和UniPrimer的3’末端部分序列相同。UniPrimer两端分别被荧光和淬灭基团标记且有发卡结构。反应时，UniPrimer结合到特异性引物扩增出的模板上作为引物进行PCR反应，在延伸的过程中UniPrimer发夹结构打开，荧光信号释放。蝎形引物为茎环结构，其5’端带有一个荧光基团FAM，3’端带有一个淬灭基团DABCYL，其环的部分序列和模板完全互补配对。体系有模板时，茎环结构稳定，荧光和淬灭基团相距近，不能检出荧光信号；体系无模板时，蝎形引物和模板特异性结合并起始PCR扩增，蝎形引物的环结构与扩增出的模板互补杂交，导致茎环结构被破坏，释放出大量的荧光信号，荧光仪器可以实时收集这些荧光信号并生成相应的荧光扩增曲线。dPCR比qPCR准确度与精密度高。

交联和裂解——稳定复合物并分离核组分:第一步对时间要求严格并且需要优化。体内共价交联稳定蛋白质-DNA相互作用并于特定时间点进行分析。通常采用甲醛交联，加入甘氨酸以终止反应。交联剂渗透到完整细胞中并将蛋白质-DNA复合物锁定在一起从而进行分析。交联剂在整个过程中保持复合物稳定，但其作用必须是可逆的才能用于ChIP。一些非常稳定的蛋白质-DNA相互作用则不需要交联。接下来，使用裂解液透化细胞膜，释放细胞组分，然后蛋白质-DNA复合物变得可溶。去除细胞溶质蛋白以减少背景信号并增加灵敏度。注意：此时可以停止ChIP测定。 经过交联，淬灭和洗涤细胞沉淀后，将裂解物于-80℃储存。自聚合酶链式反应技术被发明以来，其简单、可靠、快速、灵敏的质量，PCR是分子生物学中使用的技术。深圳酷博qPCR仪应用

Quantagene q225 系列荧光定量PCR 系统：快速 分秒必争，43 分钟完成40 循环qPCR 实验。珠海快速qPCR仪设置

TaqMan 方法的优点：需要在探针和目标分子（靶点）之间发生特异性的水解（杂交），方可生成荧光信号。可使用明显不同的报告基因染料标记探针，在一个反应管内扩增并检测两个不同的序列。无需PCR后处理，减少分析工作量并节省材料成本。TaqMan方法的缺点：TaqMan方法的主要缺点在于需要根据不同的序列，合成不同的探针。SYBR Green I染料试剂。一般将可与双链DNA发生结合的小分子分为以下两类：嵌入剂、小沟结合物。无论哪种结合方法，用于PCR实时检测的DNA结合染料都需要满足以下两个条件：结合至双链DNA时，会有增强的荧光对 PCR 不会产生抑制我们开发更加优化的条件，使得SYBR Green I染料的使用不会对PCR产生抑制并带来相对于溴化乙锭更为灵敏的检测。珠海快速qPCR仪设置

广州双螺旋科学仪器有限公司致力于精细化学品，是一家服务型公司。公司业务分为数字PCR，纯水机，病理切片机，倍性分析仪等，目前不断进行创新和服务改进，为客户提供良好的产品和服务。公司将不断增强企业重点竞争力，努力学习行业知识，遵守行业规范，植根于精细化学品行业的发展。双螺旋科学仪器凭借创新的产品、专业的服务、众多的成功案例积累起来的声誉和口碑，让企业发展再上新高。