实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）通过在普通 PCR 反应体系中加入了荧光标记探针或荧光染料，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物变化。通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。具有专一性更高、可实时监控、可重复精确定量等优势。qPCR的种类根据qPCR的化学发光原理一般分为2大类：一类是探针法，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；一类是基于SYBR Green I 的染料法，通过荧光染料来指示产物的增加。SYBR Green I 是一种结合于所有双链DNA（dsDNA）双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。苏州准确qPCR仪设置

qPCR中的荧光探针是一种短链寡核苷酸，带有荧光基团和淬灭基团，它可以特异结合目的产物的DNA序列。其检测原理是荧光共振能量转移（FRET），即荧光基团和淬灭基团在目标DNA分子扩增过程中因为聚合酶的外切活性从而水解分离使荧光信号的释放；随着扩增过程的推进，机器实时检测增强的荧光信号，从而产生终的荧光扩增曲线。根据修饰基团标记和能量转移方式，可以将探针分为TaqMan探针、分子信标和其他探针。TaqMan探针（荧光淬灭水解探针）现今常用的TaqMan探针主要是水解探针，其多是5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团的短单链寡聚核苷酸。在qPCR反应中，基于TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性，对TaqMan探针进行切割，使荧光基团和猝灭基团分离，荧光基团发出的荧光信号不会被淬灭，释放的荧光信号被机器接收。TaqMan探针的qPCR相比于染料法多了一条TaqMan探针，可以特异性结合DNA序列，因而具有更好的特异性，但探针合成价格偏高。华南地区灵敏度qPCR仪设置qPCR通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量准确，重现性比较好的定量方法，已得到全世界的公认，范围广用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

内标在传统定量中的作用：由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．内标对定量PCR的影响：若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为***。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。由于qPCR的高灵敏性，阴性对照有出现扩增信号的情况，那么在针对这类问题时，我们需要判断其原因所在。

TwoSteprt-pcr和OneSteprt-pcr的选择RealTimeRT-PCR反应可选择TwoSteprt-pcr反应或OneStepRT-PCR反应,TwoStepRT-PCR反应是将反转录反应和RealTimePCR反应分两步进行。进行TwoStepRT-PCR反应时,可选择RandomPrimer、OligodtPrimer或基因的特异性引物进行反转录反应,然后再将一部分反转录反应液(cDNA)作为模板添加到RealTimePCR反应液中。使用反转录引物时可以根据实验目的选择合适的反转录引物,如果选择RandomPrimer或OligodtPrimer,合成的cDNA可用于复数种类基因的检测,cDNA溶液可以稳定地长期保存,供以后解析使用。OneSteprt-pcr的反转录反应和PCR反应在同一反应管内连续进行,操作简单,污染几率低。但此时的反转录反应和PCR反应都并非为各自的适条件,所以OneSteprt-pcr通常比TwoStepRT-PCR反应效率低。此外,与TwoStepPCR反应相比,反转录酶等的使用量多,每个反应的成本相对较高。OneSteprt-pcr反应的反转录反应引物只能使基因的特异性PCR下游引|物,而不能使用Randomprimer或OligodtPrimer共用引物。基因表达解析等绝大部分RT-PCR,适合选择TwoSteprt-pcr反应,而RNA病毒检测等以基因检测为目的RT-CR反应,应优先考虑防止污染,所以比较好选择OneSteprt-pcr反应。实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）指的是在PCR进行的同时，对其过程进行监测的能力。华南地区灵敏度qPCR仪设置

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现每一轮循环均检测一次荧光信号的强度。苏州准确qPCR仪设置

qpcr的检测原理：qPCR主要是使用插入染料或荧光探针(例如TaqMan)，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程，然后通过标准曲线来对未知模板进行定量分析。qPCR 主要是依赖于标准品制备标准曲线，进而去确定未知样品的浓度，因此是一种相对定量的方法。随着PCR的循环进行，染料荧光强度增加，从而检测到定量反应的DNA。SYBR Green是一种DNA插入染料，范围广用于qPCR。虽然SYBR Green方法比探针方法便宜，但是特异性没有荧光探针方法好。苏州准确qPCR仪设置

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