原理：在DNA扩增反应中，通过荧光化学物质测定每次PCR循环后产物总量。目的：实现定量而不止是定性分析。通过与内参基因进行对比，对样品中的特定基因进行相对表达量的计算，以实现定量分析。qPCR的检测方法有两种，SYBRGreenl法和TaqMan探针法，下面介绍常用的SYBRGreenl法。原理：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，使其特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。试剂及仪器：Hieff®QpcrSYBR®GreenMasterMix试剂(翌圣)和ABI7500Real-TimeSystem实时荧光定量PCR仪进行qRT-PCR扩增。自聚合酶链式反应技术被发明以来，其简单、可靠、快速、灵敏的质量，PCR是分子生物学中使用的技术。深圳单通道qPCR仪供应商

PCR：Polymerase chain reaction. 是体外模拟生物的DNA 复制。需要DNA 聚合酶，DNA 模板，两端引物，脱氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP, dTTP),以及适当的缓冲体系。PCR 产物的增长形式为２N (如果各种试剂和外部所加条件均理想化，N 是循环数)。实际中，扩增效率不为100％。Real time PCR 是定量PCR 的一种，当然是在PCR 的基础上发展出来的。（普通）PCR 包含很多因素，属性，如：试剂，温度，循环数，程序，PCR 产物（扩增子，amplicon）的量，扩增曲线（扩增子累积曲线），掺错率，扩增子长度。一般来说，人们关心的是扩增子的量。而real time PCR 主要利用的是扩增曲线（amplification curve）, 循环数；扩增子长度，扩增效率，扩增子多少，也加以考虑。深圳单通道qPCR仪供应商荧光检测系统可接收荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号累积和PCR产物形成是同步。

制备DNA——解交联和DNA纯化现在含有目标蛋白质的染色质片段已分离，需要解交联并纯化DNA。解交联通常采用高热孵育和/或消化来完成。注意：此时可以停止ChIP。经过解交联和/或DNA纯化后，可以将样品于-20°C储存。定量DNA——测定目标蛋白质-DNA水平在该步骤中，通过qPCR定量纯化的DNA产物，通过qPCR，您可以确定目标蛋白是否存在于特定位点。ChIP的qPCR如何定量分析ChIP-qPCR 数据需要针对可变性来源进行标准化，包括染色质数量、免疫沉淀的效率（富集效率）和 DNA 回收率。两种常用的标准化 ChIP-qPCR 数据方法——Percent Input法和富集倍数法（Fold Enrichmen）。与input相关的ChIP-qPCR数据包括ChIP的背景水平和input染色质的标准化。建议ChIP 实验重复，尽可能将结果与背景信号和标准误差一起显示。

所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne为例，详细看一下反应设置：A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA为模板进行。C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以DNA聚合酶（ABI的需要10 分钟）。循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。G. 反应体系的设置：A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。

qPCR面对小的差异较弱，dPCR则可识别差异较小的拷贝数。

染料法是指在qPCR反应体系中加入一种与双链DNA分子结合的荧光染料，包括SYBR®Green I、BEBO和LC Green TMI等染料，它们可以与双链DNA（double strands DNA，dsDNA）的小沟非特异性结合，激发较强的荧光产生。经荧光定量PCR仪器检测后，对核酸进行定性和定量分析。qPCR 染料法原理:这种方法的优点是，需要一对特异性引物，操作简单、检测成本低。缺点是由于荧光染料非特异结合dsDNA产物，无法正确区分目的产物，尤其是染料结合引物二聚体易产生错误的扩增曲线，易形成误判。虽然在PCR扩增程序后添加熔解曲线分析，可以方便判断生成的荧光扩增曲线是否属于目的产物，但是对于高灵敏度要求的实验来说，染料法并不是比较好的选择。与标准 PCR 一样，SYBR Green 方案由变性、退火和延伸阶段组成。深圳单通道qPCR仪供应商

PCR 反应中通过控制温度变化使得核酸分子重复地解链与延伸，从而实现对目的片段的指数扩增。深圳单通道qPCR仪供应商

Quantagene q225 系列荧光定量PCR 43分钟完成实验，再加3分钟做完熔解曲线需43分钟即可完成一个40循环的常规qpcr实验。DNA熔解曲线的检测快可在3分钟内完成。使用快速试剂，30个热循环的检测更可缩短至20分钟。精密设计的加热块和孔板q225的加热块经过精密设计，能够很大程度地贴合孔板形状，实现高效的热传导，使得在加热块达到预定温度后反应溶液也能在短时间内达到相同温度，反应溶液温度更为均一。快速循环，稳定温度 q225 出色的热循环系统设计使得40 个循环的常规 qPCR 可以在短短43 分钟内轻松完成，让您的工作效率获得质的提升。整个实验过程中温度稳定，不受实验时间延长而导致的机器内部背景温度上升的影响。深圳单通道qPCR仪供应商

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