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河南相对定量qPCR服务 欢迎咨询「上海融享生物科技供应」负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。SYBRGreen法qPCR机构哪家靠谱？河南相对定量qPCR服务Real-time PCR 中引物设计的好...
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实时荧 光 定 量 PCR 的 扩 增 曲 线可 由 4 个 时 期 进 行 描 述，即基线期、指数增长期、线性增长期与平台期。在基线期 部分，强背景信号掩盖了微弱的荧光信号，故此时期无法对模 板的起始量进行分析。反应进入平台期，反应管内的 dNTP、 酶等被耗尽，反应环境已不适合 PCR 反应的进 行，此 时 的 PCR 产物不再增加，荧光信号达到水平状态，且同一模板的 多次技术重复的扩增曲线在该时期重复性差、可变性高，故 在这一时期同样不适合进行模板初始量的分析。在线性增 长期，虽然 PCR 反应仍在进行，但产物已不再呈指数形式增 ...
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切断探针后 , FAM 与 TAM RA 分离 ,荧 光信号得到释放。这时荧光探测系统就能检测到光 密度有所增加。模板每复制 1 次, 就有 1 个探针被 切断 ,并有 1 个荧光信号被释放。由于理论上被释 放的荧光基团数和 PCR 产物数是一对一的关系 ,且 光密度同被释放的荧光基团数也呈正比关系 ,因此 该技术可对模板进行准确定量。但 T aqM an 也存 在一定不足 ,主要表现在:①由于采用荧光和淬灭基 团双末端标记,因此淬灭难以彻底,本底较高。 ②报 告基团的水解利用的是 Taq 酶的 5' ※3' 外切活性, 因此定量时容易受酶活性影响。 ③探针标记成本较 高 ,不便普及应用。Ta...
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耐药基因表达的研究：目前研究中发现主要的 耐药机制有：ATP结合盒基因超家族的膜转运蛋白介导 的耐药，这些蛋白包括：MDR-1基因编码的P-糖蛋白， 多药耐药相关蛋白，肺耐药相关蛋白，乳腺耐药蛋 白等；酶介导的耐药，包括拓扑导构酶，谷胱甘肽及谷 胱甘肽-S-转移酶，蛋白激酶C，脱氧胞嘧啶核苷激酶等， 凋亡基因介导的耐药，如bcl-2家族，p53基因，c-myc 等。多药耐药是多因素，多种机制共同作用的结果。 real-time反转录 PCR是了解耐药指导临床策 略的有用手段，它能观测用药前后及复发时细胞的 耐药基因mRNA表达变化...
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实时荧光定量 PCR 技术的分类：荧光探针法：水解探针法。水解探针的结构特点是寡核苷酸序列 的 5′端为荧光报告基团，3′端 为 荧 光 淬 灭 基 团。PCR 扩 增 前，探针游离于靶序列外，报告基团发出的荧光被淬灭基团 吸收，检测不到荧光，但有时会因淬灭不彻底，会检测到微 弱的荧光。在 PCR 退火时，探针特异性地结合到靶序列上， 在延伸阶段，利用 Taq 酶 5′-3′外切酶的活性将探针水解， 荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，荧光信号被释放，并与 PCR 产物的数量成正相关。由于水解探针的作用机理依赖 于 Taq 酶 5′-3′外切酶的...
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x - 轴表示 PCR 循环数, y - 轴表示扩增 反应的荧光值 ,与反应管中扩增产物的量有比例关 系。扩增曲线有指数增长期和非指数平台期 2 个阶 段。在指数增长阶段,每个循环 PCR 产物量大约增 加一倍。然而随着反应的进行, 反应体系组成成分 的消耗,反应进入平台期。只有在荧光信号扩增期 PCR 产物量的对数值 与起始模板量之间存在线性关系 , 可以在指数期的 某一点上来检测 PCR 产物的量,并由此推断模板初始的含量。设定一定的荧光信号的域值 (thresh - old)。如果检测到荧光信号超过域值, 就被认为是 真正的信号 ,它可用于定义样本的域值循环数 Ct (C 表示循环 cy...
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实时荧光定量 PCR 的数据分析 在指数增长期，PCR 产物量以指数形式增加，根据这一 原 则，假设扩增效率为 E，模 板 起 始 量 为 N0，m 个 循 环 后 PCR 产物量为 Nm，则有 Nm=N0（1+E）m（1），对 该 等 式 两边 取 对数，则有 LgN0=-m·lg（1+E）+Lg Nm（2），若循环数达到某一 CT 值时，荧光阈值为 Q，式（1）可写成：Q=N0（1+E）CT，式（2） 可 写 成 ：LgN0=-CT·lg （1 +E） +LgQ。 当 需 要 对 靶 基 因 在 mRNA 水平上进行表达量分析时，通 常 采 用...
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Absolute Quantification 标准曲线的各 项指标：斜率、扩增效率（E）、相关系数（R2 ）、间距均需进行 严格评价，从而确保该曲线的可用性。各点间距应相等，间 距以及斜率的Absolute 值应满足 3.100~3.582，相关系数 R2＞0.99， 扩增效率（E）在 90%~110%之间。扩增效率、斜率以及间距 三者相互关联，扩增效率（E）=10（-1/斜 率 ） -1，斜率的Absolute值恰 是各点之间的平均间距。当扩增效率＜90%时，间距以及 斜 率的Absolute 值会＞3.582；当扩增效率＞110%...