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组织免疫荧光染色

来源: 发布时间:2024-01-05

细胞免疫荧光主要用于蛋白定位研究和细胞内信号转导,细胞免疫荧光技术是利用免疫技术和荧光标记技术相结合,原理就是利用抗原-抗体反应之后,采用荧光标记,标记完成后,显微镜下观察细胞内某种抗原成分的多少,从而做出一个定位研究,也可以为细胞内信号传导提供一个明确的指导,细胞免疫荧光具有敏感性强、特异性高、速度快的特点,是目前比较常用的组织学技术,也是比较精确的。免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗结合,其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗,荧光显微镜下即可观察到荧光。荧光抗体法是利用荧光标记的抗体来追踪或检查相应抗原的方法。组织免疫荧光染色

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其他荧光物质:1.酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应,一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮,后者可发出荧光,激发光波长为360nm,发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基乙酸等。2.镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕(Eu3+)、铽(Tb3+)、铈(Ce3+)等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光,其中以Eu3+应用较广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽,发射光波长范围窄,荧光衰变时间长,较适合用于分辨荧光免疫测定。所需要的仪器:荧光显微镜、显微荧光分光光度计、流式细胞仪和时间分辨荧光计等仪器激光共聚焦显微镜。CD31免疫组化免疫荧光技术可以用于研究病毒传播和免疫应答。

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细胞免疫荧光可以观察蛋白在细胞中的定位,以及一些特殊信号分子蛋白的出核/入核的定位变化。在进行细胞免疫荧光过程中,需要用到细胞爬片,通过将爬片浸在细胞培养基内,细胞在爬片上生长,进而进行细胞的免疫荧光。实验前准备:1.胰酶;2.DMEM细胞培养基;3.细胞培养12孔板或者6孔板;4.爬片。间接免疫荧光的优点:通过增加能够与一抗结合的二抗数量进行信号放大;与直接免疫荧光相比,通过信号放大提高检测灵敏度。免疫荧光技术是一种以荧光素标记抗体来定位抗原物质的高度发达的标记免疫技术。

荧光的猝灭:荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭,这是由于激发态分子的电子不能回复到基态,所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂,以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光(特别是紫外光)的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染,以减弱非特异性荧光本质,使特异荧光更突出显示。免疫荧光技术可以通过荧光显微镜观察样品中的荧光信号,从而确定目标分子的存在和位置。

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免疫荧光技术的主要特点是:特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是:非特异性染色问题尚未完全解决,结果判定的客观性不足,技术程序也还比较复杂。荧光免疫法按反应体系及定量方法不同,还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比,荧光免疫法无放射性污染,并且大多操作简便,便于推广。国外生产的TDM用试剂盒,有相当一部分即属于此类,并且还有TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。由于一般荧光测定中的本底较高等问题,荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。新发展了几种特殊的荧光免疫测定,与酶免疫测定和放射免疫分析一样,在临床检验中应用。使用荧光抗体方法是免疫荧光技术中常见的操作步骤。Glut2免疫荧光

免疫荧光技术可以用于研究细胞内分子的相互作用。组织免疫荧光染色

zo-1的免疫荧光,步骤如下:1.细胞在盖片上生长融合到95%-100%时,从孵箱中取出。2.用预温的1×PBS洗3次,每次10分钟。3.4%的甲醛室温固定20-30分钟。4.1×PBS洗3次,每次10分钟。5.0.2%TritonX-100透化2-5分钟。6.1×PBS洗3次,每次10分钟。7.5%BSA室温封闭30分钟。8.加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里,4度过夜。9.1×PBS洗3次,每次10分钟。10.加二抗(用1%BSA稀释)30分钟,闭光。11.1×PBS洗3次,每次10分钟。12.95%甘油封片。注:4%甲醛,0.2%Triton,5%BSA均用1×PBS稀释。组织免疫荧光染色

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