这些常用免疫组织化学方法的原理如下：

1. 免疫荧光细胞化学技术

将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量.

2. 免疫酶细胞化学技术

是免疫组织化学研究中较好常用的技术．基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究．

3. 免疫胶体金技术

就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究．由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究

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免疫胶体金技术

免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。

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织材料的处理

  组织材料的处理是获得良好免疫组织化学结果的前提，必需保证要检测的细胞或组织取材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失、不扩散和被破坏（下节 详述）。

  三、免疫染色

  可在细胞涂片或组织切片上进行免疫染色。一般程序是：①标记抗体与标本中抗原反应结合；②用PBS洗去未结合的成分；③直接观察结果（免疫荧光直接法）；或显色后再用显微镜观察（免疫酶直接法）。在此基础上发展出间接法，多层法，双标记法等各种方法，将在本书各有关章 节 内详述。

封片

为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。免疫荧光方法中的重要环节

1）冰冻切片制备

建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。

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众所周知，冰冻切片较突出的优点就是能够较完好地保存抗原的免疫活性  ，即具有抗原敏感性高的优点  。因此对冰冻切片通常不进行抗原修复 ，而在作免疫组化的研究时往往需要对组织进行固定，固定液（如多聚甲醛、福尔马林）使组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原有一定的封闭作用  ，从而降低了抗原敏感性。考虑到以上原因，我们对冰冻切片进行高温高压抗原修复并作对比研究。高通量转录组测序找融享生物。山西免疫组化服务

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DAB显色

背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（比较好一抗4℃过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

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