如果想要达到这样的目的,那么就需要细胞冷却液,这种东西怎样配置呢?下面就来具体的了解一下,细胞冻存液的配方是什么?(一)细胞冻存1.配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液;2.取对数生长期的细胞,去除旧培养液,用PBS清洗。3.去除PBS,加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来;4.离心1000rpm,5min;5.去除胰蛋白酶,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的**终密度为5×106/ml~1×107/ml;6.将细胞分装入冻存管中,每管1~7.在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;8.冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。space(二)细胞复苏1.从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。2.从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;3.离心,1000rpm,5min;4.弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度。无血清细胞冻存可直接放入-80℃冰箱。南京原代细胞冻存液供应商
去除旧培养液,用PBS清洗1-2次;去掉培养瓶里的残余血清;3、加入适量胰酶(浓度一般为),使胰酶覆盖整个瓶,放入培养箱消化;4、细胞消化(具体时间根据镜下形态判断),显微镜下观察细胞,细胞胞质回缩,细胞间不再连接成片,此时加入完全培养基终止消化;5、用巴氏吸管轻轻吹打细胞,形成细胞悬液,将细胞悬液1000r/min左右条件下离心3-5min;6、弃上清,加入适量预先配制好的冻存液,巴氏吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中的细胞更终密度为5×106/ml~1×107/ml;7、将细胞分装入冻存管中,每管;8、冻存管标记细胞名称,冻存时间,操作者及细胞代数信息。对于悬浮细胞冻存,则直接收集离心细胞,除去胰酶消化的步骤,其他步骤相同。注意事项1、需冻存保种的细胞应在生长良好且存活率高,其密度约为80-90%的状态。细胞冻存前应保证细胞的活力好,无污染。2、在细胞冻存过程中,所结的冰晶对细胞伤害较大,所以过程一定要慢。冻存或者复苏更好用新配制的培养液。浙江快速细胞冻存液公司100ml无血清细胞冻存液储存条件是2-8℃下12 个月。
进行瓶口消毒,弃去细胞原来的培养基。按每25cm2/ml胰酶/EDTA消化液比例加入消化液,放入显微镜下观察,待所有细胞变圆后立即拿入超净台内,加入2ml细胞完全培养基以立即终止消化。采用无菌***头轻轻吹打细胞表面,注意吹打全部培养表面,可以按照先左右吹打,后上下吹打的方式,取所有细胞悬液放入一干净的15毫升离心管内。配平离心:采用天平配平两端,每分钟800转,室温离心5分钟。采用罗氏CASY-DT快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。加入10mlCASY-ton至以标记viable的管子中,加入100μl细胞悬液,颠倒混匀三次,可进行细胞计数。可见每毫升悬液中有活细胞总数。取出冻存管,注明细胞名称、代数、日期。离心后,以无菌吸管吸弃上清液,不要吸到底部的细胞沉淀。将细胞沉淀与冻存液充分混匀,根据计数结果,将细胞总数调节至细胞数量为每毫升有5×10?为宜。将细胞冻存悬液分装入细胞冻存管中,一般一个两毫升冻存管装入1至毫升细胞冻存悬液为宜。严密封口后,进行程序性降温冻存:首先﹣4℃30分钟,20℃30分钟,﹣80℃过夜,**后进行液氮保存。另有一种比较实用的降温方法:用**少两厘米厚的医用棉纱将冻存管紧紧包裹,扎紧,直接放入-70℃冰箱。
不同细胞系请参照附表。细胞系冻存密度备注正常人成纤维细胞1-3x106cells/mL杂交瘤细胞1-3x106cells/mL某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。贴壁肿瘤细胞5-7x106cells/mLHela除外,1~3×106cells/ml即可其他悬浮细胞5-10x106cells/mL人淋巴细胞高密度冻存效果好干细胞类1-2x107cells/mL支持高密度冻存MSC细胞,为常规血清冻存液的10倍。2、细胞冻存过程a)将要冻存的细胞悬液,进行细胞计数,计数后离心,800转,3min即可。b)弃去上清,将4度保存的无血清冻存液缓慢加入离心后的细胞沉淀中,根据密度调整细胞冻存液用量。c)反复吹吸混匀后,分装于细胞冻存管中,每管500ul-1000ul(建议500ul/管)。d)将分装好的细胞冻存管,直接置于-80度冰箱过夜保存,次日投入液氮中保存即可。特别提醒:1.冻存过程中,第2步和第3步在冰袋附近操作时,低温避免保护剂对细胞造成损伤。2.细胞冻存管一定要保证完全密封,否则在复苏过程中有可能会炸裂。3、细胞复苏过程a)提前开启水浴锅,温度调节到37度。b)将冻存的细胞冷冻管从液氮中取出,迅速置于水浴锅中,尽量1min内融化,时间越短对细胞影响越小。南京翌科生物科技有限公司无血清细胞冻存液比较靠谱。
对本发明的技术方案进行修改或等同替换,均属于本发明的保护范围。实施例1细胞冻存液的制备以1l体积为标准,按照下列组分的含量,称取对应的重量:上述两组分充分混匀形成细胞冻存液。实施例2脐带血细胞的冻存采用实施例1所述细胞冻存液,在冻存前24小时,将该冻存液置于2-8℃进行温度平衡,以脐带血细胞为例制备细胞悬液,取800ul细胞悬液,按按细胞悬液(v):细胞冻存液(v)=4:1计算加入细胞冻存液的体积200ul,并以稳定速率加入细悬液中,这一过程需要在15min之内完成,同时需要不断进行混合,使得细胞冻存液能够在细胞悬液中均匀分布。随后,将充分混匀的细胞溶液分装至,进行程序性降温至-80℃后转至液氮中储存。从液氮系统中取出冻存的脐带血细胞样品,等待1~2min使残余液氮挥发之后,迅速放入37℃水浴中,待可见冰块刚好要消失至黄豆大小体积时,取出细胞样品计算细胞存活率。细胞存活率结果如表1所示。实施例3间充质干细胞的冻存采用实施例1所述细胞冻存液,在冻存前24小时,将该冻存液置于2-8℃进行温度平衡,以间充质干细胞为例制备细胞悬液,取800ul细胞悬液,按按细胞悬液(v):细胞冻存液(v)=4:1计算加入细胞冻存液的体积200ul,并以稳定速率加入细悬液中。做无血清细胞冻存液哪个公司好?扬州通用型细胞冻存液应用
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