非商业转载请注明出处。注意事项：错误的时机：细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。解决：**佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。2.细胞太少：冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。解决：离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。3.盖子不紧：冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。解决：选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。4.单薄的冻存盒：放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。解决：选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！）：放在－80度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）解决：尽快转入液氮。6.液氮不足：液面不能漫过所有细胞解决：定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。7.取错细胞：找不到/拿错冻存管。解决：每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。二、细胞复苏：方法：从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子。冷冻下的无血清细胞冻存液什么样。苏州原代细胞冻存液配制比例

    去除旧培养液，用PBS清洗。3.去除PBS，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来;4.离心1000rpm，5min;5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的**终密度为5×106/ml～1×107/ml;6.将细胞分装入冻存管中，每管1～7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者;8.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min;当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。space(二)细胞复苏1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀;3.离心，1000rpm，5min;4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度。10%-15%（常见为10%）的DMSO或甘油，含10%-20%血清的冻存培养液。一般来讲血清含量可以在10%-90%之间调整，冻存液中加入血清一方面可以为细胞提供营养，另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质，如蔗糖。南京细胞冻存液供应商无血清细胞冻存液在2-8℃稳定保存1年以上。

    DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇、丙醇、和甲酰胺等。这类保护剂能够在细胞冷冻悬液完全凝固之前，穿过细胞膜渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤。同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。该类保护剂主要包括聚yi烯吡ge烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及***等。其保护机制的假设很多，其中一种可能是，聚yi烯吡ge烷酮等大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量。使冰点降低。减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。01细胞冻存的原理细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，也是保持细胞活性和增殖能力的重要手段。细胞可以通过被暂时休眠（冻存），仿佛童话里的睡美人，留住年轻芳华，等到需要时再被轻轻唤醒（复苏）。低温下，活细胞中的生物和化学反应都会极大降低，为细胞长期冻存提供了可能。冷冻对大多数活生物体都是致命的，细胞冻存是利用冷冻保护剂来降低冰点，缓慢冻结细胞的过程中，细胞内水分透出细胞。

    在不附加任何保护剂下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在﹣130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞冻存时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，待复苏时重新进入生长分裂周期。实验开始前，将冻存管、15毫升离心管、移液管、移液枪、***头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30分钟。采用通风机通风3分钟。以75%酒精擦拭操作台和双手。准备好冰盒。将离心机调节至800转，5分钟。水浴箱调节至37度恒温。取细胞完全培养基、DMSO、胰蛋白酶等，放于水浴箱中预热。首先消毒双手和超净台。取约10ml细胞完全培养基放于15毫升离心管中。配置细胞冻存液：冻存液应该提前配制，置于室温备用，防止临时配制产生的热量损伤细胞，按无血清培养基比血清比DMSO=7:2:1的比例配置细胞冻存液，其中加大冻存液中血清的比例对于保存某些脆弱的干细胞以及一些比较珍贵的细胞很有好处的。按比例加好冻存液组分后，轻轻吸打混匀，置于室温下待用。从细胞培养箱中取出细胞。南京翌科生物科技有限公司无血清细胞冻存液比较靠谱。

    提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。对于一些原代细胞（皮肤细胞），除渗透型保护剂外，还会适当添加表面型保护剂（海藻糖），以提高细胞存活率。所需材料?超低温冰箱或液氮罐??20%以上血清的完全培养液或血清?DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121℃蒸气高压消毒)?2ml**细胞冻存管?吸管、离心管、喷灯、冻存管架贴壁细胞的冻存1．选择处于对数生长期的细胞，在冻存前*****好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入等量完全培养基终止消化。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。然后将细胞收集于离心管中离心(200g，5分钟)。2．去上清液，加入含20%以上小牛血清的完全培养基或血清，于4℃预冷15分钟后，加入10%的DMSO，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，分装于细胞冻存管，细胞浓度为3×106～1×107/ml之间。3．将上述细胞分装于冻存管中，将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。4．先将冻存管置入置于4℃30min，再转入-20℃2h后。无血清细胞冻存液使用的是什么技术？浙江通用型细胞冻存液公司

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    产品简介：在细胞体外培养工作中，为了达到长期保存细胞的生物活性的目的，须将细胞进行冷冻保存，并在实验需要的时候将其重新复苏和培养。目前，细胞冻存更常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用添加适量保护剂使细胞缓慢降温至指定温度范围，从而到达保护细胞的目的。EKBIOTech无血清细胞冻存液是EKBIO技术团队在长期的细胞研究过程中针对细胞的冻存和复苏不断优化实验条件，面向数百种细胞研发出的特点使用冻存液产品。该产品添加了细胞沉降稳定剂，可延缓细胞在冻存过程中的沉降速率，防止细胞互相挤压，影响细胞冻存效果。另外，添加了细胞膜保护剂、渗透性细胞膜内保护剂、非渗透性细胞保护剂等多种冷冻保护剂，这些成分在溶液中同水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而少冰晶的形成，能极大降低细胞在冻存过程中冰晶对于细胞的损伤，有效提高细胞复苏存活率。该产品配方成分明确，不含血清、不含动物源性蛋白，可减少各类细菌、病毒和支原体等污染，保证冻存细胞的安全；574d075a-6771-4443-9ef3-0ba适用于常规细胞系、原代细胞，同时亦适合于无血清培养细胞和蛋白表达细胞。与传统冻存液相比。苏州原代细胞冻存液配制比例

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