《Adv Sci》解读：野马追内酯靶向USP7抑制神经炎症

来源：发布时间：2025-01-21

迄今，临床上仍有大量疾病缺乏安全有效的治L 药WU 。因此，药WU 创新研究的重要性日益凸显。中药虽然在临床预防治L 复杂疾病方面具有其特色和优势，但是中药有效成分及其作用靶点、机制不明确等问题仍然是中药现代化的阻碍因素，也是中药发展和走向世界的主要瓶颈之一。

2022年8月，北京大学药学院屠鹏飞/曾克武团队在Science Advances（IF=11.7）上发表题为“Neuroinflammation inhibition by small-molecule targeting USP7 noncatalytic domain for neurodegenerative disease therapy”的研究成果。通过HuProt?人类蛋白质组芯片筛选揭示中药野马追活性成分野马追内酯B（Eupalinolide B，EB）变构调控靶点USP7，进而通过Keap1/Nrf2通路发挥抗神经炎症及改善神经退行性疾病的分子机制。

Highlights如下：

1）EB抑制BV-2小胶质细胞的活化；

2）USP7为抗神经炎症小分子EB的细胞靶点；

3）EB作为USP7抑制剂改善神经退行性疾病的发病机制；

4）机制上，EB通过选择性地修饰非催化性HUBL结构域中的共价异生位点Cys576，异生抑制USP7，导致Keap1的泛素化依赖性降解，而Keap1功能的丧失进一步导致小胶质细胞中抗神经炎症基因的Nrf2依赖性转录 JI活。

功能研究：

EB抑制BV-2小胶质细胞的活化；药WU 性USP7抑制可减弱小胶质细胞的 JI活介导的神经元损伤，从而明显改善痴呆症和帕金森病小鼠模型的行为障碍。

机制研究：

（1）USP7为抗神经炎症小分子EB的细胞靶点

第一步，HuProt?人类蛋白质组芯片筛选EB的潜在细胞靶点USP7

为探索EB使小胶质细胞失活的潜在细胞靶点。合成生物素标记的EB (bio-EB)，用于探测HuProt蛋白质组芯片，然后与cy3标记的链霉亲和素孵育（图1a）。信噪比（SNR）比较高的蛋白被鉴定为USP7 (SNR为19.06)（图1b）。

第二步，验证EB与USP7的结合

细胞热位移分析（CETSA）和药WU 亲和力响应性靶点稳定性（DARTS）分析显示EB与USP7的结合（图1c-d）。Pull down实验显示，，bio-EB明显拉下USP7，加入过量的EB则阻止USP7的拉下（图1e）。接下来，表面等离子体共振（SPR）分析显示，EB与USP7特异性结合，解离常数（KD）为6.85 μM（图1f）。使用Ub-Rh110底物进行的USP7活性测定表明，EB明显抑制USP7的Ub-Rh110水解能力[抑制常数（KI）为24.98 μM]（图1g）。后续功能实验提示敲低USP7科明显逆转EB介导的NO、IL-6和TNF-α下调。表明EB在小胶质细胞中选择性地与USP7结合。

（2）通过小分子EB依赖性的变构调节机制抑制USP7

第一步，USP7通过氢键和范德华相互作用参与稳定EB结合

为了探索EB在USP7上的结合结构域，SPR分析发现EB选择性地与非催化的HUBL结构域相互作用。随后确定apo-HUBL结构（2.3 ?）和HUBL与EB复合物的共晶结构（2.35 ?）（图1h）。EB的α、β-不饱和部分作为反应性Michael受体，并与Cys576形成共价键（图1h）。Asp666、Arg723和Glu572通过氢键和范德华相互作用参与稳定EB结合（图1h）。

第二步，EB在变构调节机制中使USP7失活。

为了表征EB介导的USP7抑制的可能动力学机制。产生USP7构象的三种模型，在与USP7^CD123对齐的apo-HUBL结构中，HUBL的C端肽到CD的距离为60 ?，表明USP7是开放构象。与底物DNMT1结合后，距离缩短至24 ?，形成闭合USP7构象。在USP7 HUBL-EB结构中，EB将Ubl 3拖到Ubl 5向外弯曲，将C端肽和CD分离了近80 ?，从而形成了USP7的过度开放构象（图1i-j）。表明EB介导的USP7构象过度开放破坏了C端肽与CD的接触，从而在变构调节机制中使USP7失活。

图1 USP7为抗神经炎症小分子EB的细胞靶点，USP7 HUBL与EB配合物的结构（Ref. Fig 1/2）

（3）Keap1是小胶质细胞中USP7去泛素化的直接底物

第一步，筛选USP7底物蛋白

基于氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）蛋白质组学，其中5种在EB处理后明显下调（图2a）。其中，Keap1在炎症过程发挥关键作用。因此，推测Keap1可能是USP7 JI活小胶质细胞的潜在底物蛋白。放线菌酮（CHX）细胞，发现EB依赖的Keap1降解明显加快（图2b）。

第二步，验证USP7与Keap1相互作用

Co-IP实验发现，USP7与Keap1相互作用（图2c）。免疫荧光分析显示EB通过促进USP7核转位来抑制USP7-keap1共定位（图2d）。USP7敲除消除了EB介导的Keap1降解（图2e），表明USP7是小胶质细胞中Keap1稳定性的关键决定因素。分别构建USP7和Keap1的截短体进行Co-IP实验，发现USP7的TRAF结构域促进了USP7-Keap1的相互作用（图2f）。

第三步，验证USP7直接去泛素化Keap1

体外泛素化实验显示，在Cul3， Rbx1, ubiquitin， E1和E2-UbcH5a的体外环境中，观察到keap1泛素化，而USP7可以抑制keap1泛素化，EB则明显增加了Keap1泛素化（图2g）。为研究usp7介导的Keap1去泛素化是由K48还是K63介导，进行Co-IP实验。发现在USP7敲低或EB处理后，Keap1的K63和k48连接的泛素化明显增加，表明USP7对Keap1的去泛素化具有位点非选择性（图2h）。蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂Baf-A1处理细胞显示，EB促进Keap1降解，Baf-A1逆转了EB介导的Keap1降解，但对MG132没有逆转，表明Keap1降解是通过自噬依赖的方式进行调控的（图2i）。综上所述，Keap1是USP7在小胶质细胞中的泛素化降解底物。

图2 Keap1是小胶质细胞中USP7去泛素化的直接底物（Ref. Fig 3）

结论：研究人员发现EB抑制BV-2小胶质细胞的活化。通过HuProt?人类蛋白质组芯片筛选，USP7是EB下游直接靶标。功能上，EB可以通过靶向USP7抑制小胶质细胞的 JI活，从而达到抗神经炎症的作用；另外，药WU 性USP7抑制可减弱小胶质细胞的 JI活和由此产生的神经元损伤，从而明显改善痴呆症和帕金森病小鼠模型的行为障碍。机制上，EB通过选择性地修饰非催化性HUBL结构域中的共价异生位点Cys576，抑制USP7，导致Keap1的泛素化依赖性降解，而Keap1功能的丧失进一步导致小胶质细胞中抗神经炎症基因的Nrf2依赖性转录 JI活。为通过靶向USP7抑制小胶质细胞介导的神经炎症来治L 神经退行性疾病提供了一个有吸引力的未来方向。