industryTemplate常见的300种人、小鼠和大鼠基因表达Assay均已在QIAcuity数字PCR平台上经过验证。天津Digital PCR数字PCR服务

与传统qPCR技术相比，数字PCR技术具有极高的灵敏度、特异性和精确性，但截止目前而言，数字PCR对广大科研工作者仍然是一种全新的检测方法，我们在看待数字PCR的应用前景时，更应该保持一种开放的心态，与其说数字PCR技术是一个新的检测平台，不如把它视为一种全新的技术思路和手段，在这个平台上必将有更多的应用帮助我们深入到分子生物学研究的更高层次。数字PCR被称为第三代PCR技术，相比于传统的PCR技术和荧光定量PCR技术，其具有诸多优势：（1）***定量，不依赖标准品和参考曲线，定量结果更加准确可靠；（2）高灵敏度，可实现单分子级检测；（3）高分辨率，适合在大量背景模板的干扰下对罕见的目标分子进行检测；（4）高稳定性，对抑制剂的耐受程度**增强。凭借这些优势，数字PCR被广泛应用于多个不同的领域[4]，特别是生物医学领域，包括稀有突变检测、基因拷贝数变异检测、基因表达研究、甲基化水平检测、**液体活检、无创产前检测、微生物（病毒、细菌等）检测、移植排斥监控和二代测序辅助建库等。此外，此技术也被用于农业、食品安全和环境科学等诸多领域。PCR数字PCR共同合作一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应。

值得注意的是，在gDNA长度≥20kb或进行拷贝数变异检测实验时，必须对样品进行酶切处理，确保大片段DNA序列或串联序列在酶切处理后，模板随机且均匀的进入**反应体系，以实现准确和精确的定量。数字PCR实验离不开包含有Mg2+、dNTP、Buffer和DNA聚合酶等PCR反应所需要的MasterMix。随着实验的不断深入，对于实验条件的要求也不断提高，其中DNA聚合酶对实验的准确性起着至关重要的作用。由于非热启动的DNA聚合酶在反应体系易使引物在室温条件下发生非特异性扩增，直接影响实验结果。

20 世纪末，Vogelstein等提出数字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA 模板) ，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。与 qPCR 不同的是，数字PCR不依赖于CT值，因此不受扩增效率影响，扩增结束后通过直接计数或泊松分布公式来计算每个反应单元的平均浓度(含量)，能够将误差控制在5%以内，数字PCR 可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现***定量分析。通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。

ddPCR主要有Bio-rad公司开发的QX200系统和Rain Drop系统，QX200可以将体系分割成2万个微滴，Rain Drop可以分割成100万-1 000万个微滴。ddPCR原理是通过将一个待分析的PCR反应体系进行微滴化处理，利用微滴发生器制成近20 000个油包水小微滴从而对原始体系进行分割，样品中的核酸分子随机分配到大量**的微滴中，每个微滴中含有一个或不含待检核酸分子。对微滴体系进行扩增反应以后，分析每个微滴的荧光信号，进行有或无的判断，将判断结果按照泊松分布的原理，通过读取靶标和内参核酸的阳性微滴个数以及比例从而得到靶分子的拷贝数及浓度。与芯片式dPCR相比，操作简单，可以实现高通量的检测，也保证一定程度上的微滴检测稳定性。影响引物探针特异性的因素有很多种，譬如纯化方式、设计方法以及引物探针的修饰技术等。PCR数字PCR共同合作

开发多靶点检测的多重数字PCR检测，可以通过多种荧光染料或标记技术来实现。天津Digital PCR数字PCR服务

单细胞的基因表达分析：基因表达分析有助于了解细胞和组织的特征及其如何应对发育和环境信号的改变。检测已知和未知基因转录水平的方法在过去的四十多年来发生了翻天覆地的变化，变得更加有效，更加敏感，定量更加精细，能够一次性对大量的基因转录本进行分析。但是，在组成复杂的细胞混合物中，尽管***表达的基因可以被识别出来，但来自于少数细胞群体（例如干细胞）的转录本却很可能会被掩盖掉，尤其是在每个细胞中以低丰度形式出现的转录本。为了解决这个问题，单细胞检测技术应用而生，而且逐渐受到了越来越多的重视。ddPCR在单细胞分析中的优势在于它不需要标准曲线就能进行***定量。而且，由于能够以非常高的敏感性区分至少五种不同的基因转录本，因此无需进行其他方法所要求的单细胞cDNA预扩增，这可以消除预扩增和NGS文库准备中潜在的转录本定量失真，能够能加真实的反映单细胞群体中关键基因的特征。天津Digital PCR数字PCR服务