双光子显微成像技术不是什么新技术，早在20多年前就有了，目前已经在生命科学和材料科学中广泛应用。几年前双光子过期后，已经推出自己的双光子显微镜的厂家估计不少于10家以上。即便如此，世界上很多实验室都搭双光子，自己搭的好处有很多，首先是便宜，尤其是实验室已经有飞秒激光器，那就更很省钱了。其次是灵活，可以选择针对特殊用途的搭配，改动也灵活。好处就是可以锻炼队伍，一趟走下来可以把新手带出来，后期维护也更加自由。当然坏处也不少，首先是操心，特别是第1次搭的时候，开始要想方案，后来要解决各种实际问题。其次是花时间，加上买配件的时间，比买一台现成的商业化双光子耗时长。现在已经有不少关于如何搭双光子显微镜的文章，各种protocol，大多是老外写的，中文的较少。其实完全自己搭一套好用的系统还是不容易的，尤其是没有经验的时候，容易走弯路，多花钱，也多花时间，再加上双光子的重要器件都需要从国外购买，在国内买这些东西耗时较长。因此，我想总结一下我们的经验，贴出来分享，希望能帮到想自己动手的实验室，双光子显微镜有这么多优点，那么双光子显微镜有哪些应用呢？进口双光子显微镜荧光探测

而配合了双光子激发技术，激光共聚扫描显微镜则能更好得发挥功效。那么，什么是双光子激发技术呢？在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子使电子跃迁到较高能级，经过一个很短的时间后，电子再跃迁回低能级同时放出一个波长为长波长一半的光子（P=h/λ）。利用这个原理，便诞生了双光子激发技术。双光子显微镜使用长波长脉冲激光，通过物镜汇聚，由于双光子激发需要很高的光子密度，而物镜焦点处的光子密度是比较高的，所以只有在焦点处才能发生双光子激发，产生荧光，该点产生的荧光再穿过物镜，被光探头接收，从而达到逐点扫描的效果。国内ultimainvestigator双光子显微镜成像视野是多少双光子显微镜角膜成像。

Denk很快就将双光子显微镜用于神经元成像，而1997年在Svoboda测量完整老鼠大脑的锥体神经元的感官刺激诱导树突钙离子动态后，双光子显微镜的潜能开始完全凸显。值得一提的是，霍华德·休斯医学院Svoboda实验室和Thorlabs在2016年合作推出了一种强大的多光子介观显微镜，其成像视场达到5毫米，能够跨多个脑区进行高速功能成像。根据清华大学单一采购来源的**指导意见：这种显微镜的视场是普通双光子显微镜的10倍。30年来，双光子显微镜已成为较厚生物组织三维成像中不可或缺的工具。从双光子到三光子甚至四光子，这种非线性成像技术通常也被统称为多光子显微镜。自1990年以来每年发表的多光子显微镜文章数量，发展速度可见一斑。

激光共聚扫描显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。组织样品中的荧光物质受到刺激后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测***时先聚焦，然后被光探头收集，转化为信号输送到计算机进行处理。这个装置能让通过探测***的只有焦平面上发出的荧光，使成像更为清晰准确，同时通过改变物镜的焦距，能对不同焦平面进行扫描，通过计算机绘出普通显微镜无法观测的三维图像。双光子显微镜可以进行厚的组织样品拍摄。

双光子显微镜为什么穿透能力强？生物组织在近红外波段存在两个窗口,第1个近红外窗口对应波长在700nm-900nm,第2个近红外窗口对应波长在1000nm-1400nm之间。举例说明就是单晶硅对于可见光几乎是不透明的，但是对于红外波段就像是“水晶”一样通透性很好了。原因有两点：1.生物组织对红外光的吸收弱，对可见光吸收强。类似的，平时用手电筒照射手指，会看到手通透红亮，也是由于生物组织对长波长的红光吸收少。2.生物组织对红外光的散射弱。因为瑞利散射的强度反比于波长λ的四次方。类似的，早晨的太阳非常红，也就是因为长波长的红光穿透力更强。这两点共同导致长波长的红外光比可见光对生物组织的穿透能力强。这种双光子显微镜的视场是普通显微镜的10倍。国外激光双光子显微镜图像对比度

双光子显微镜中，同样每个时刻只有焦平面上一个点的信号被探测，并且连焦平面外的荧光信号也不会有。进口双光子显微镜荧光探测

从双光子的原理和特点我们就可以明显的得出双光子的优点：☆光损伤?。河捎谒庾酉晕⒕凳褂玫氖强杉饣蚪焱夤庾魑し⒐庠矗庖徊ǘ蔚墓舛?**细胞和组织的光损伤小，适用于长时间的研究；☆穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力，因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题；☆高分辨率：由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收只局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内；☆漂白区域?。河捎诩し⒅淮嬖谟诮坏愦Γ越沟阋酝獾那蚨疾换岱⑸馄紫窒?；☆荧光收集率高：与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器（共焦***），这样就提高了对荧光的收集率，而收集率的提高直接导致图像对比度的提高；☆图像对比度高：由于荧光波长小于入射波长，因而瑞利散射产生的背景噪声只有单光子激发时的1/16，较大降低了散射的干扰；☆光子跃迁具有很强的选择激发性，所以可以对生物组织中一些特殊物质进行成像研究；进口双光子显微镜荧光探测