数字PCR系统的分散方式决定了分散数量,其结果基于统计的方法进行定量,增加反应单元数量(统计样本量),可以增加其检测的容量和动态检测线性范围达到和qPCR相近的动态范围,同时减小一个反应单元中包含多个分子所造成的误差,达到提高灵敏度和准确度。影响dPCR定量结果的因素包括:仪器采用的分散方式与数量、溶液稀释方法、分散体积的准确性以及结果表达方式。分散方式与数量由数字PCR系统决定,分散体积和结果表达方式需要实验人员在实验过程中优化得到。dPCR的测量结果通常表示为含量,即拷贝数转基因质量百分比,而QPCR结果通常表示为拷贝数的质量分数。臻准数字PCR试剂盒
在精细诊疗领域,患者外周血中的循环DNA(ctDNA),在的早期筛查,围术期监测,药物疗效评估,预后等方面具有重要的临床应用价值。在肺液体活检领域,EGFR突变由于其在东亚人群中的高突变率,实现精细检测显得尤为重要。研究表明,相较于荧光定量PCR,数字PCR对于血液ctDNA的检测灵敏度更高(0.01%),EGFR突变的阳性检出率也更高。在患者术后复发检测中,数字PCR评估出的ctDNA阳性,可以早于影像学数月提前揭示出患者复发。因此,该项技术在肺精细诊疗中具有重要的作用。深圳双螺旋生物仪器数字PCR无创产前筛查有望成为数字PCR在临床快速落地的应用。
微滴数字PCR主要是将两种互不相溶的液体,以其中一种作为连续相(油),另一种作为分散相(水),在水/油两相表面张力和剪切共同作用下分散相以微小体积单元的形式存在于连续中,从而成液滴。这种液滴式的反应腔室具有体积小、样品间无扩散等优势。在ddPCR中,利用微滴发生器可以一次生成数万乃至百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴,作为数字PCR的样品分散载体。这里,液滴中包裹了单拷贝DNA模板和PCR反应液,然后将液滴收集在PCR反应管中进行扩增。?PCR反应结束后检测每个微滴的荧光信号。目前Bio-Rad公司的QX100系统、QX200系统均为采用液滴技术的数字PCR系统。图6.Bio-Rad的液滴数字PCR系统
对于检测需要高灵敏度以及技术确认的情况下,数字PCR技术也可以发挥重要作用。技术数据表明,数字PCR技术对的比较低检测下限可到2copies/ml,比qPCR灵敏度提升了100倍。经测试,数字PCR在检测和诊断的某些方面优于金标准qPCR,尤其是在低病毒载量样本中,相比起qPCR,数字PCR特异性、灵敏度、重现性和检测限受影响更小。因此,未来预计数字PCR技术也将在类疾病中得到更加广的应用。数字PCR的应用甚广,除了可应用于进行突变的检测以外,也可运用于基因扩增的检测。通过数字PCR技术可建立多重荧光体系,用于同时检测比如非小细胞肺中常见的MET和HER2耐药扩增。有研究报道,使用数字PCR技术对436例非小细胞肺样品进行检测,并挑选样本验证了数字PCR与RNA fish的检测一致性。结果表明,该数字PCR技术在保证了基因扩增检测准确性的同时,还节约了检测时间。dPCR可直接溯源SI国际单位制摩尔,适合单一、双重及多重转基因标准物质研究,一次可识别不同的转基因区域。
20世纪末,Vogelstein等提出数字PCR(digitalPCR,dPCR)的概念,通过将一个样本分成几十到几万份,分配到不同的反应单元,每个单元至少包含一个拷贝的目标分子(DNA模板),在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增,扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA聚合酶依赖的酶促合成反应,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。数字PCR是直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的定量。上海医疗系统认证数字PCR技术
数字PCR适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域。臻准数字PCR试剂盒
ThermoFisherQuantStudio3D是另一个经典的芯片式数字PCR平台,其基本的检测流程是:将反应液加入到涂布器中,通过涂布器将反应液均匀涂布在有20000个微孔的芯片上,将芯片放在PCR仪上扩增,将芯片放入读取仪中采取拍照的方式读取荧光信号。操作较为复杂,整个过程在封闭的芯片中进行,污染的风险较低。STILLANaica是一个较新的数字PCR平台,基本的检测流程是:将反应液加入芯片,将芯片放入微滴生成扩增系统,生成30,000个微滴单层平铺于芯片中,PCR扩增在芯片上完成。然后将扩增后的芯片转移至微滴阅读分析系统,采取拍照的方式读取荧光信号。由于整个过程在封闭的芯片中进行,污染的风险较低。臻准数字PCR试剂盒
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