数字PCR是一种核酸分子定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法,光度法基于核酸分子的吸光度来定量;实时荧光定量PCR(RealTimePCR)基于Ct值,Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数;数字PCR是的定量技术,基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量,是一种定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法,将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中,每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后,有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号,没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积,就可以推算出原始溶液的核酸浓度。全自动数字PCR一体机可以适用于包括医疗检测领域在内的多种应用场景。广东数字PCR系统
相比于qPCR,dPCR在转基因检测中具有以下优势:(1)检测灵敏度高:理论上dPCR的灵敏度可达1个拷贝,而实际应用中dPCR的小检出限和比较低定量限数值非常接近,所以dPCR可以在非常低的目标拷贝数下得到精确的结果;通常转基因比参考基因(内源基因)浓度低很多;(2)前处理简单且受基质成分干扰较小:dPCR反应效率和精密度受到食品基质成分干扰影响较小,可应用于混合基质样品中低丰度DNA的检测;(3)dPCR对抑制剂的敏感性较低:由于dPCR结果表示为“有荧光“或“无荧光”,即使存在抑制剂降低了荧光强度仍可以表示为“有荧光;(4)适合多重转基因检测:食品或饲料提取的DNA中可能包含多种转基因片段,可以进行多重dPCR检测,提高分析效率。同时,dPCR可以直接溯源至SI国际单位制摩尔,适合单一、双重及多重转基因标准物质研究,一次可识别不同的转基因区域。下面详细进行说明。上海全自动多重数字PCR价格通过数字PCR技术可建立多重荧光体系,用于同时检测比如非小细胞中常见的MET和HER2耐药扩增。
数字PCR技术是继一代普通PCR、二代荧光定量PCR之后的第三代PCR技术。该技术将一个样本分成几到几十万份,分配到不同的反应单元,每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板),在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增;扩增结束后,将有荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0,终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例,计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。定量:不再依赖于Ct值和标准曲线,直接给出靶序列的起始浓度,实现真正意义上的定量。更高灵敏度与特异性:数字PCR可实现万分之一稀有样本的定量,可用于极微量核酸样本检测、复杂背景下的稀有突变检测、表达量微小差异鉴定、单细胞基因表达等方面。数字PCR在分子诊断领域将会发挥巨大的作用,数字PCR适用于生物标志物研究、拷贝数变异分析、微生物检测、转基因生物检测、mRNA和miRNA检测、基因相对表达研究等,并对遗传病、、产前诊断的研究提供了一种全新的技术思路与手段,具有广的、不可替代的应用前景。
20世纪末,Vogelstein等提出数字PCR(digitalPCR,dPCR)的概念,通过将一个样本分成几十到几万份,分配到不同的反应单元,每个单元至少包含一个拷贝的目标分子(DNA模板),在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增,扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA聚合酶依赖的酶促合成反应,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。杨雁峰博士坚信数字PCR是可以应用于无创产前筛查的理想技术之一,这也是他2016年创立塔歌生物的初衷。
dPCR的测量结果通常表示为含量,即拷贝数值或转基因质量百分比,而QPCR结果通常表示为拷贝数的质量分数。目前市场上可购买到大多数转基因标准物质,以qPCR定值的标准物质是以拷贝数(单倍体基因组当量)的质量分数来表示特性量;以dPCR定值的标准物质直接采用拷贝数比例来表示特性量。不同方法使用不同的表示方式,会造成测量结果不可比。因此质量分数、拷贝数和拷贝数比例之间的关系需要转化,才能得到单位一致,数值可比的数据。EU联合研究中心建议使用转换因子从拷贝数换算到质量分数。检测结果部分为阳性,部分为阴性,之后进行分子数统计,不需做标曲。法国微滴式数字PCR
通过创新技术微流控芯片,让数字PCR单反应耗材价格进入个位数,实现了新的进步,也降低开发难度。广东数字PCR系统
数字PCR产品的发展,为不同场景下的多样化核酸检测需求提供了新的思路,尤其是在医学检验方面,在 性疾病早期检测、病症的液体活检、无创产前检查等领域展现出良好的应用前景。实现 性疾病早期高效检测——以病毒为例,有病毒检测、和临床样本病毒载量评估He监测环境病毒载量;二代荧光定量PCR检测技术是目前病毒检测的"金标准",但由于病毒探针结合位点突变、样本病毒载量不足等原因,在临床检测过程中经常出现假阴性结果,由于数字PCR具有更高的灵敏度、精细度,以及其适合痕量样本检测的特性,能够检测出荧光定量PCR检测过程中错过的 ,可作为后者的补充。在人群筛查及临床诊疗中,为科学选取采样方式,需要评估不同临床样本病毒载量,如鼻咽拭子、血尿、粪便、肺泡灌洗液等,由于数字PCR可提供一定程度上量化指标,为采样方法的选取提供了参考,从而提高检出率。在外防输入的战略要求下,环境病毒检测工作尤为重要,数字PCR可对低核酸丰度样本进行有效检测,包括从不同环境中取样的样本,如病房、医院卫生间、实验室等等,在病情防控中起到了不可忽视的作用。此外,数字PCR的应用场景还有病程不同阶段的病毒载量评估、核酸参考品制备、抗病毒药物研发等环节。广东数字PCR系统
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