人体内多种细胞及体液均可分泌外泌体,包括内皮细胞、免疫细胞、血小板、平滑肌细胞等。当其由宿主细胞被分泌到受体细胞中时,外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。外泌体介导的细胞间通讯主要通过以下三种方式:一是外泌体膜蛋白可以与靶细胞膜蛋白结合,进而靶细胞细胞内的信号通路。二是在细胞外基质中,外泌体膜蛋白可以被蛋白酶剪切,剪切的碎片可以作为配体与细胞膜上的受体结合,从而细胞内的信号通路。有报道称一些外泌体膜上蛋白在其来源细胞膜上未能检测出。三是外泌体膜可以与靶细胞膜直接融合,非选择性的释放其所含的蛋白质、mRNA以及microRNA。外泌体(Exosome)发现于1986年,是一种直径约30~100nm的双层膜囊泡状结构小体。开封正规外泌体提取试剂服务电话
外泌体的提取、分离方法:尺寸排阻色谱法和超滤法;尺寸排阻色谱法是利用分子筛理论,较初是根据蛋白质分子大小分离蛋白质的色谱技术。该方法的主要优点是不需要很大的离心力,从而保证了外泌体的完整性。Mol等[13]对比超高速离心和尺寸排阻色谱法得到的外泌体蛋白,结果显示,后者得到的外泌体的蛋白丰度高于前者。这些基于过滤或尺寸排阻色谱的新方法为外泌体大规模的生产和临床应用提供了可能。超滤也是根据外泌体的尺寸将其分离出来的一种方法,超滤一般被认为是外泌体分离过程中的一个准备过程,通过超滤除去大分子和小分子的蛋白质。不过连续的超滤可以分离出外泌体,和超高速离心相比,超滤不需要特殊的设备就可以较短时间内分离出外泌体。但是,超滤膜对外泌体的黏附作用会降低外泌体的产量,并且超滤过程中施加的外力可能会使外泌体变形或者破裂。开封正规外泌体提取试剂服务电话将人尿液来源细胞的培养基通过0.22微米滤膜过滤,以去除大的细胞残片以及其它杂质。
由于这些核酸被囊膜包裹而被保护,稳定性高,不易降解,是一种用于一些病症诊断和预后监测的非常理想的新型生物标记物一些疾病的早期诊断、用药监控、预后判断。近年来,随着人们对外泌体的研究和认识加深,外泌体检测作为一种新型的液体活检热点技术已被许多临床科研机构普遍地应用于一些病症和疾病的无创诊断、治病和监测;如何高效地提取外泌体是实现这项新兴液体活检技术临床常规化应用的关键。外泌体(Exosome)是从体液(尿液、血液、唾液、腹水、胸腹水等)和细胞液中快速提取的,其是活细胞分泌到胞外的囊泡样小体,含有多种蛋白和核酸分子(DNA、RNA、以及miRNA),在体内细胞间物质和信号转导中起到重要作用。
作为一种分子通断开关的KRAS发生突变时会处于“开启”状态。在80%~95%的胰腺导管腺病(PDAC)当中,这个基因发生突变,这也是这种一些疾病中较为常见的突变。这些研究人员证实iExosome能够运送特异性地靶向KRAS的siRNA和shRNA分子,并且比他们的合成对应物脂质体(liposome)更加高效。脂质体不具有外泌体表现出的天然复杂性和优势。德州大学MD安德森一些疾病中心一些疾病生物学助理教授ValerieLeBleu博士说,“我们的研究提示着与脂质体相比,外泌体表现出运送siRNA分子和压制侵袭性胰腺瘤生长的优异能力。我们也证实外泌体表面上的CD47存在允许它们躲避来自循环单核细胞的吞噬作用。”近年来,随着人们对外泌体的研究和认识加深。
外泌体研究的主要应用:外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型,其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、一些病症侵袭等方方面面。有研究表明一些病症来源的外泌体参与到一些病症细胞与基底细胞的遗传信息的交换,从而导致大量新生血管的生成,促进了一些病症的生长与侵袭。一些病症。一些病症转移。来自白血病干细胞的外泌体促进急性骨髓性白血病(AML)细胞的增殖、迁移和压制细胞凋亡。治病靶标。利用外泌体递送小干扰RNA来沉默KRASG12D,从而特异性高效靶向至胰腺病细胞,以明显降低RAS活化、病细胞增殖和转移过程。免疫。β细胞将含有蛋白质和miRNA的外泌体释放到细胞外,并可转移到其他代谢部位或免疫内皮细胞,有利于维持葡萄糖体内平衡或造成胰岛素抵抗。心血管。外泌体介导miR-155从平滑肌细胞转移到内皮细胞导致了内皮细胞的损伤促进动脉硬化。分子标记。疾病诊断。在酒精性肝病、NASH、菌类性肝炎、药物性肝损伤和肝细胞病中发现循环EVs的水平上升用无菌针管吸取上层含有外泌体的液体,置于80℃储存备用。金华外泌体提取试剂生产厂家
外泌体的提取、分离方法:聚合物沉淀法。开封正规外泌体提取试剂服务电话
具体步骤是:以下所有步骤都在4℃下进行,1、300×g10min,弃沉淀,去除细胞2、2000×g20min,弃沉淀,去除死细胞3、10,000×g30min,弃沉淀,去除细胞碎片等亚细胞成分4、10,000×g70min,弃上清,沉淀即为外泌体5、PBS(每10ml细胞培养液用30mlPBS重悬)清洗沉淀物,混匀,10,000×g70min6、lmlPBS溶解沉淀(外泌体),立即使用或置于-80℃备用。7、一般超速离心法会结合密度梯度离心,这样得到的外泌体更纯,具体做法第4步后蔗糖梯度离心,10,000×g70min,以去除密度大于1.21g/ml的颗粒。优点是:成本低,操作简单,获得的囊泡数较多。缺点是:耗时耗力(需用时8-30h,并且每次只能处理6个样本),获得的外泌体纯度不是很高,高速及重复离心也会对外泌体产生很大的伤害,并且不适用于如血浆和血清等粘性液体生物样本。开封正规外泌体提取试剂服务电话