血友病是一组**为常见的遗传性凝血障碍,根据因子缺陷的不同分为甲、乙两型,(Ⅷ、Ⅸ因子缺陷),也有复合型血友病,但不常见。甲型血友病发病率为1/10000,Ⅷ因子基因位于G6PD基因附近,全长186Kb,大范围的基因重排(缺失、插入、重复)导致甲型血友病的病例很少,*为Ⅷ因子缺陷的5%,大部分病人表现为单个或少数碱基的突变。由于Ⅷ因子基因长度为186Kb,突变位点多,而且新生突变频率高,从临床角度讲不能对每一个突变都检测,可对**为常见的几种突变类型进行检测,主要的检测手段是PCR结合RELP分析。乙型血友病发病率占血友病的20%,其基因变化及检测方法与甲型血友病类似。区别雄性及雌性的物质基础是性染色体,哺乳动物胚胎发育中,雌性表型不需要任何调节,而雄性表型则由多因素决定,位于Y染色体上的指导雄性性别分ss化的基因命名为睾丸决定因子(TDF)。现代研究表明,SRY(Sex-determiningregionofYchromosome)基因是TDF基因,位于Y染以体短臂末端。SRY区缺失易导致46XY核型个体发育成女性。进行基因检测可以检出SRY基因组的易位及缺失,从而诊断性别发育异常,这一探索性别异常的研究非常热门。另外还有一种46XY核型异常的病人即睾丸女性化,这是用于雄***受体。 由于PCR简便易行、灵敏度高等有点,该技术被应用于多数分子实验的研究中。国产梯度PCR仪销售电话
基本的PCR须具备:1.要被复制的DNA模板2.界定复制范围两端的引物(四种脱氧核苷酸)及水。利用升温使DNA变性,在聚合酶的作用下使单链复制成双链,进而达到基因复制的目的。PCR的设想核酸研究已有100多年的历史,二十世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制。Mullis使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段,其缺点是:①Klenow酶不耐高温,90℃会变性失活,每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行,容易发生模板和引物之间的碱基错配,其PCR产物特异性较差,合成的DN段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。 高校科研实验室国产PCR仪销售电话在医学检验学中,pcr仪对传染疾病的诊断意义尤为重要。
引物设计时使合成的寡核苷酸链(18~24聚物)适用于多种实验条件仍不失为明智之举。②引物的二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3’末端形成的二聚体,应控制其ΔG大于,因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性,引物中间或5’端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构,也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大;影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外,与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。③引物GC含量和Tm值PCR引物应该保持合理的GC含量。含有50%的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56~62℃范围内,这可为有效退火提供足够热度。一对引物的GC含量和Tm值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差,因为降低了Tm值导致特异性的丧失。这种情况下引物Tm值越高,其错误引发的机率也越大。若采用太高的退火温度,Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。在从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时,这种GC含量和Tm值的协调非常关键。一般来说。
基因实验室与PCR实验室的规划布局要求:1、环境要求通风、温度和湿度实验室的长期使用,有毒、有害等污浊气体不及时排出会危害室内操作人员健康。实验室良好的通风环境是必要前提。除了实验室建筑选址的朝向和所处地域的气候特征,实验室通风系统也是必须考虑的问题。通风柜作为保持实验室内安全、卫生的重要柜体,是建立一个科学实验室必不可少的组成部分。洁净度实验室的洁净,除了实验室地面、实验室器具的清洁,还要考虑实验室内空气的洁净度。不良的空气质量会影响实验的正常进行,扩散到空气中的有害物质也会危害到人体健康。2、设施要求给排水、排污系统标准规范的实验室,都会配置有供水、排水和排污系统,实验台配置水池、滴水架、排水槽,通风柜与通风柜管道联通。3、实验室工作人员要求PCR实验室内工作人员必须参加由国家卫生部或各省临床检验中心举办的临床基因扩增培训班,并持证上岗。PCR实验室通过验收,实验室至少必须应有两个以上持有“临床基因检测上岗证”。PCR实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序(SOP)、建立系列质量管理文件等,确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求,确保检测结果准确、确保实验室卫生安全。荧光定量PCR因操作方便、运行速度快、实验结果准确,受到越来越多的分子生物学研究者青睐。
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PCR扩增过程中,荧光定量PCR仪通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。国产梯度PCR仪销售电话
原位PCR仪:用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪称作原位PCR仪。如病源基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。是保持细胞或组织的完整性,使PCR反应体系渗透到组织和细胞中,在细胞的靶DNA所在位置上进行基因扩增。不但可以检测到靶DNA,又能标出靶序列在细胞内的位置,对于在分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有重大的实用价值。主要应用于临床、科研。原位PCR仪,主要应用于:检测外源性基因片段,提高检出率,集中在病毒的检查上,如HIV、HPV、HBV、CMV等;观察病原体在体内分布规律;内源性基因片段,如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRN段、基因片段等;检测导入基因;遗传病基因检测如β-地中海贫血。实时荧光定量PCR仪:在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统的PCR仪称作荧光定量PCR仪。其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同,只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出。把这种PCR仪叫做实时荧光定量PCR仪。国产梯度PCR仪销售电话
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