基因重排或重组。当基因zhiliao产品所用载体及其携带的基因发生复制时，可能出现非zhiliao目的非预期的基因表达或改变，或者与相应野生型或辅助病毒互补后产生回复突变或意外复制或形成6新的病毒。免疫原性。由于基因zhiliao产品在体内的持续暴露或者需要多次给药等情况，机体可能产生针对基因zhiliao载体或编码的作用因子的免疫应答。由于基因zhiliao产品在靶细胞或组织中的表达时间、分布范围或表达强度等差异，机体免疫应答的后果可能从不具有临床意义的一过性的免疫反应，到针对靶细胞或组织的免疫攻击，甚至产生严重危及生命的不良事件。种子基因脱靶检测，推荐唯可生物，实验实力强，专业性高，检测效率高，结果准确率高。南京脱靶检测报告

围绕大家关心的CRISPR基因编辑安全性问题，我们首先对CRISPR脱靶位点检测技术进行一次大盘点，在sgRNA设计阶段需要如何做才能够尽可能地避免脱靶现象的发生。较简单的脱靶位点检测方法是全基因组测序（WGS），但在实际使用中，即使测序深度达到100X，也很难发现一些低频率的脱靶位点，同时测序成本却非常高。为弥补WGS的这些缺陷，常见的脱靶位点检测技术都需要对脱靶位点进行捕获富集，来提高检测灵敏度，降低测序成本。按照实验原理的不同，脱靶位点检测技术可以分为细胞外、细胞内和其他特殊方法这3类。江苏crispr脱靶检测安全性评价内基因编辑技术可能造成的脱靶效应,建立了一种被命名为GOTI。

细胞外检测方法：细胞外检测方法较为直接，将基因组提纯后进行CRISPR体外切割实验，再捕获发生脱靶切割的位点即可。1) Digenome-seqDigenome-seq是较早提出的一类细胞外脱靶位点检测方法，提纯的基因组DNA被Cas9/sgRNA切割后，再经过标准的全基因组测序流程获得测序数据，之后需要较为复杂的生物信息学分析才能够获得CRISPR切割位点的信息。总体来讲，这种方法测序成本较高，并且检测灵敏度也有限。2)SITE-seq为了有效检测到低频脱靶位点，一般需要在建库时定向捕获CRISPR切割位点。SITE-seq就是这样一种测序方法，提纯的基因组DNA经过Cas9/sgRNA切割后，在切割位点末端连接带Biotin的接头；再随机打断基因组，在另一端连接第二个接头；经过链霉亲和素磁珠纯化，只有一轮被Cas9切割的DNA才能够被纯化并测序，实现了CRISPR切割位点的富集。该方法虽然提高了脱靶位点的检测灵敏度，但有着较高的实验要求，每次需要投入大量的基因组DNA，并且无法区分提纯基因组DNA时发生的随机断裂和Cas9的切割，导致产出较为明显的背景信号。同时，由于一轮Biotin接头只会接在Cas9切割位点的一侧，导致测序结果里只能看到脱靶位点一侧的序列。

长期随访的观察时间长期随访的持续时间应确保足以观察到受试者因产品特性、暴露情况（生物分布和给药途径）等导致的风险，应不短于迟发性不良反应的预期发生时间。一般而言，针对不同类型的基因zhiliao产品建议如下：?具有基因组整合活性的载体（例如γ-逆转录病毒和慢病毒载体）和转座子元件建议观察不短于15年。?可以产生持续ganran、或有潜伏再jihuo风险的细菌或病毒载体（如单纯疱疹病毒）建议观察15年或至数据表明不再存在任何风险（ganran或再jihuo）。基因编辑产品建议观察15年或至数据表明不再存在任何风险。?腺相关病毒载体建议观察5年或至数据表明不再存在任何风险。脱靶检测guide-sequence，推荐唯可生物，实验实力强，专业性高，检测效率高，结果准确率高。

BLESS：利用生物素标签对DSBs进行原位标记，后经PCR扩增实现对于生物素标记片段的富集，并通过二代测序实现脱靶位点检测。直接检测细胞中的切割位点，灵敏度与细胞、组织密切相关。LAM-HTGTS，片段化的gDNA经过LAM-PCR引入接头，然后进行全基因组易位测序。高通量的全基因组范围检测，可准确检测DSBs引发的重排。GUIDE-Seq，将dsODN    s标签整合到DSBs位点，通过二代测序检测这些标签所在的基因组区域，从而确定脱靶突变的位置。广使用的细胞内检测方法。能检测低频脱靶突变。Digenome-Seq，片段化的gDNA与CRISPR/RNP混合孵育，进行全基因组测序检测脱靶。全基因组测序，直接检测切割位点，能检测低频脱靶突变。高深度全基因组重测序服务,该方法能多方位精细地对基因编辑的细胞或个体进行off-target检测。苏州种子脱靶检测实验室

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插入突变风险评估一些整合性载体（如逆转录病毒、慢病毒、转座子）可将外源基因插入整合到细胞基因组中，这可能会导致关键基因突变或jihuo原基因，从而导致恶性liu风险增加。影响插入突变的关键风险因素包括：（1）载体的整合特征，如插入位点的偏好性；（2）载体的设计，如增强子、启动子等构建元件的活性，影响邻近基因的潜力；产生剪接突变体的潜在剪接位点或多聚腺苷酸信号等；（3）细胞载体拷贝数；4）转基因表达产物的功能活性（如与细胞生长调控相关）和表达水平；5）靶细胞群的转化可能性，这可能与细胞的分化状态、增殖潜力、体外培养条件和体内植入环境等有关。南京脱靶检测报告