免疫荧光注意事项：对照实验的设置：1、内源性组织背景对照：某些细胞和组织可能有固有的生物学性质，会产生背景荧光，对结果产生影响，例如色素脂褐质。因此在孵育一抗前，应对样品进行观察，确保抗原本身没有信号。2、阳性对照：用确认含有待测抗原的组织或细胞，与待测标本进行统一处理，结果应为阳性，可证明待测抗原有一定活性并且实验过程中用的试剂及方法均可靠。3、阴性对照：与阳性对照相反，用明确不含有待测抗原的细胞或组织切片染色，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。免疫荧光技术可以用于研究食品安全和生物安全。PDL-1/CD274免疫荧光染色

细胞的固定及免疫荧光：1)吸除培养基，一般先加入PBS浸洗细胞 3 次，每次 5 min。2)向孔内加入4%多聚甲醛1ml，进行细胞固定，室温固定20分钟。3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。4)向孔内加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透20min，目的是使细胞通透。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。6)用10%的与二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封闭2小时（选择的封闭液与后面操作过程中抗体稀释液一致）。封闭后不需要用PBS清洗。7)吸去封闭液，向每孔滴加足够量适宜浓度的一抗（一次使用抗体可以根据抗体说明书推荐浓度，后续实验可以摸索抗体的适宜浓度），4℃湿盒内孵育过夜。CD45免疫荧光检查荧光抗体技术具有高灵敏度和高特异性，可以实现精确的免疫检测。

细胞免疫荧光简单实验步骤如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小时。2. -20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟。3. PBS洗净：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗净：2×5 min。6. 羊血清封闭：37度，20分钟。7. 一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度，1-2小时。8. 4度PBS洗净，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小时。10. 37度 PBS洗净，3×5 min。11. 凉干封片（封闭液PH8.5）；不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时。

细胞免疫荧光实验常见问题:1、信号弱或者无信号：细胞或组织样本保存时间过长；2）抗体浓度不合适，参照抗体说明书的稀释浓度，再根据样本表达量进行摸索；3）一抗孵育时间不合适，建议 4 ℃ 过夜孵育。2、高背景：封闭不充分；抗体浓度过高；抗体孵育时间过长或温度过高；清洗不充分；样本变干，染色过程确保样品始终浸没于液体环境中.3、非特异性染色较多：固定液残留，这里需要缩短固定时间并且在封闭液中加甘氨酸，并且抗原修复也可以帮助解决非特异性染色；二抗残留，二抗需要用带有吐温 20 的 PBS 溶解，只要荧光显微镜的强度还可以增大，那么就可以增加吐温洗脱掉非特异性染色。荧光抗体法是利用荧光标记的抗体来追踪或检查相应抗原的方法。

细胞免疫荧光实验注意事项：非特异性染色：是否灭活内源性过氧化物酶；孵育过程中干片；抗原热修复过度。染色过深：一抗浓度过高；染色试浓度过高或孵育时间过长；染色剂浓度过高或孵育时间过长。通常实验室先固定细胞再进行通透，但若检测抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，这样可以通过通透去除一些水溶性蛋白，进而可降低免疫荧光背景和非特异性信号；建议设阴性对照组，消除由于抗体非特异性结合而产生的背景染色；选择醛类固定液时，保持其新鲜度，较好现配现用，使用不新鲜的醛类固定液自发荧光背景会升高。免疫荧光技术可以用于研究动物模型和药物筛选。MYeloperoxidase免疫荧光分析

免疫荧光技术是一种利用荧光物质标记抗体来定位抗原的技术。PDL-1/CD274免疫荧光染色

细胞的固定及免疫荧光：注意事项：（1）取细胞爬片时，动作应轻柔，防止将细胞爬片夹碎，影响实验进程。（2）种细胞过程中，要注意将细胞轻柔混匀，“八”字或者“十”字形摇晃，防止细胞局部生长过密。（3）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光。（4）细胞爬片进行免疫荧光之后，需要尽快拍照，防止免疫荧光淬灭?；蛘叻庞诎岛心?，暂时保存于4度冰箱，尽快拍照。（5）在进行荧光显微镜拍照时，要根据荧光抗体选择合适的激发光源。PI/DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色，只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光。PDL-1/CD274免疫荧光染色